سنجش شار کلسیم برای مطالعات عصبی در شرایط آزمایشگاهی و غربالگری دارو

Marcela Laukova ، دکترا و مایکل پی. شاکرجیان ، دکترا |گروه بهداشت عمومی ، بخش علوم بهداشت محیط ، دانشکده علوم بهداشت و عمل |کالج پزشکی نیویورک ، Valhalla ، NY

کتی اولسن ، دکترا |دانشمند برنامه Sr. |دستگاه های مولکولی

نورونها سلولهای تحریک کننده الکتریکی در سیستم عصبی مرکزی و محیطی هستند که اطلاعات را از طریق سیگنال های الکتریکی و شیمیایی پردازش و انتقال می دهند. این سیگنال ها از طریق سیناپس ها اتفاق می افتد که به نورونهای متصل به یکدیگر اجازه می دهد تا شبکه های عصبی را تشکیل دهند.

یون های کلسیم به عنوان یک پیام رسان داخل سلولی ضروری در نورونهای پستانداران خدمت می کنند و تعداد زیادی از سیگنال های داخل سلولی را تولید می کنند که عملکردهای عصبی کلیدی را کنترل می کنند. در پایانه های پیش سیناپسی ، هجوم کلسیم باعث ایجاد اگزوسیتوز وزیکولهای سیناپسی حاوی انتقال دهنده عصبی می شود ، در حالی که از نظر پس سیناپسی ، افزایش گذرا از سطح کلسیم در ستون فقرات دندریتیک برای القای پلاستیک سیناپسی وابسته به فعالیت ضروری است. سیگنال های کلسیم داخل سلولی فرایندهایی را که در یک محدوده زمانی گسترده کار می کنند ، از انتشار انتقال دهنده عصبی در مقیاس میکرو ثانیه گرفته تا رونویسی ژن ، که از چند دقیقه تا ساعت طول می کشد ، تنظیم می کنند.

چندین کانال قابل نفوذ در کلسیم در غشای پلاسما وجود دارد (به عنوان مثال کانال های کلسیم ولتاژ دروازه دار ، و همچنین کانال های لیگاند ، از جمله گیرنده های استیل کولچولین Ampa- و نیکوتین) ، که شار کلسیم را در سلولهای عصبی تحت شرایط فیزیولوژیکی قرار می دهد. بشردرک چگونگی تغییر گیرنده های مختلف و آگونیست های آنها این تنظیم کننده مهم عملکرد عصبی در سلامت و بیماری می تواند به توسعه تعدیل کننده های شیمیایی جدید ، در درجه اول در مطالعات سمیت عصبی و در تولید دارو کمک کند.

تصویربرداری کلسیم یا نظارت بر تغییرات در کلسیم داخل سلولی ، یک روش بسیار مفید برای بررسی انواع نقش هایی است که یون های کلسیم در نورونهای عملکردی ایفا می کنند. اندازه گیری مستقیم شار کلسیم پویا در شبکه های عصبی نشان می دهد که چگونه نورون ها سیگنال ها را از فضای خارج سلولی پردازش می کنند ، به عنوان مثال ، پاسخ به افزودن انتقال دهنده های عصبی یا داروهای دارویی که باعث تغییر در سطح کلسیم داخل سلولی می شوند.

در اینجا ، ما امکان سنجی اندازه گیری شار کلسیم داخل سلولی در نورونهای قشر مغز اولیه را در قالب میکروپلیت با استفاده از کیت قلبی اولیه EarlyTox in در ترکیب با خواننده میکروپلیت چند حالته FlexStation ® 3 نشان می دهیم ، که امکان کنترل ترکیب برای نظارت بر زمان واقعی کلسیم را فراهم می کند. سینتیک. نرم افزار SoftMax ® Pro کمیت سیگنال لازم را برای مطالعات دقیق تر عصبی و در نهایت توسعه دارو فراهم می کند. در نرم افزار SoftMax Pro ، الگوریتم های تجزیه و تحلیل Peak Pro می توانند انواع مختلفی از ویژگی های اوج ، از جمله تعداد اوج ، فرکانس اوج ، دامنه اوج ، عرض اوج ، زمان اوج افزایش ، زمان اوج پوسیدگی و فاصله اوج را محاسبه کنند (شکل 1).

شکل 1. نمونه هایی از پارامترهای محاسبه شده توسط الگوریتم تجزیه و تحلیل Peak Pro در نرم افزار SoftMax Pro. حداکثر 14 ویژگی مختلف اوج را می توان با استفاده از پروتکل های سنجش قلبی اولیه از پیش تنظیم شده اولیه در کتابخانه پروتکل نرم افزار محاسبه کرد.

برای نشان دادن فسیبلی این روش ، ما از tetramethylenedisulfotetramine (تترامین ، TETS ، TMDT در اینجا) استفاده کردیم ، یک جوندگان نوروتوکسیک بسیار قدرتمند مسئول بسیاری از مسمومیت های عمدی و تصادفی در انسان. اقدامات TMDT شامل محاصره ورود یون کلرید از طریق GABA است_Aکانالها ، که منجر به دپلاریزاسیون بدون بررسی ، هجوم بیش از حد کلسیم به سلولهای عصبی و تحریکات تحریک شده و در نتیجه تشنج با صرع وضعیت نسوز ، ناهنجاری های قلبی ، کما و مرگ می شوند. در حال حاضر هیچ پادزهر خاصی وجود ندارد و یک رویکرد سیستماتیک مبتنی بر شواهد برای کشف بهترین اندازه متقابل وجود ندارد. بنابراین ، ما یک روش غربالگری معتبر در شرایط آزمایشگاهی با استفاده از نورونهای قشر اولیه برای شناسایی سریع پادزهرهای بالقوه در برابر TMDT و سایر عوامل مشابه ایجاد کردیم.

در اینجا ، ما نشان می دهیم که کتامین ، از جمله سایر داروها ، به طور موثری افزایش ناشی از TMDT در کلسیم داخل سلولی را معکوس کرده و بنابراین می تواند از اثرات عصبی این ماده جلوگیری کند. این داده های آزمایشگاهی مشاهدات قبلی ما را در یک مدل موش تأیید کرد ، جایی که کتامین پتانسیل نجات موش ها را از تشنج کشنده و مرگ و میر ناشی از TMDT به روش وابسته به دوز نشان داد (شکرگیان و همکاران 2012). این روش نشان دهنده یک جایگزین قابل اعتماد و مقرون به صرفه در شرایط آزمایشگاهی برای آزمایش حیوانات در فرآیند شناسایی پادزهر بلکه در توصیف عوامل ناشناخته درگیر در مدولاسیون کلسیم داخل سلولی است.

مواد و روش ها

تهیه کشت عصبی قشر اولیه

نورونهای قشر اولیه از یک سد موش باردار در روز حاملگی جدا شدند. این سد طبق یک پروتکل اخلاقی مورد تأیید محلی قربانی شد. کل رحم جدا شد و در یک ظرف پتری با نمکی سرد فسفاتد شده (PBS) قرار گرفت. جنین ها از رحم خارج شدند و به یک ظرف پتری دیگر حاوی PBS سرد در یک هود کشت بافت در شرایط استریل منتقل شدند.

سرهای جنین های انفرادی با استفاده از قیچی کوچک برداشته شد و به یک ظرف پتری دیگر از PBS تازه و سرد منتقل شد. از فورس های کوچک برای ثابت نگه داشتن سر استفاده شد و از سایر فورسپس ها برای باز کردن دقیق جمجمه بدون آسیب رساندن به بافت مغز استفاده شد. سپس مغز با از دست دادن جزئی لامپ های بویایی از استخوان های جمجمه دور شد. مخچه و لامپ های بویایی باقی مانده از هر مغز برداشته شدند.

مغزهای جداگانه در یک ظرف پتری به PBS استریل منتقل شدند. کار در زیر یک محدوده جداکننده با بزرگنمایی در حدود 1. 8 برابر ، هر مغز سمت پشتی به سمت بالا بود. نیمکره ها کمی از هم جدا شدند و سپس برش دادند تا آنها را جدا کنند. سپس یک نیمکره چرخانده شد تا طرف میانی (مسطح) رو به بالا باشد و از دو فورس (شماره 55) برای نوار مننژها از نیمکره استفاده شد. از یک ForceP برای ثابت نگه داشتن نیمکره استفاده شد در حالی که دیگری برای گیره در اطراف هیپوکامپ استفاده می شد. سرانجام ساقه مغز برداشته شد و قشر مغز را ترک کرد. کل روش با نیمکره دیگر تکرار شد.

تمام قشر ها جمع آوری شدند (اختیاری: هیپوکامپ ممکن است برای کشت اولیه هیپوکامپ یا برای سایر برنامه ها استفاده شود) و در حالی که هنوز در PBS به قطعات تقریباً 1 میلی متر برش داده می شود. حدود 2 میلی لیتر محیط متشکل از 1 میلی لیتر DMEM با 7. 5 ٪ سرم گاوی جنین غیرفعال شده با گرما (FBS) و 1 میلی لیتر محیط کامل عصبی (محیط عصبی حاوی 2 ٪ مکمل B27 بدون سرم ، 0. 5 میلی متر گلوتاماکس-I و 10μg/ml جنتامایسین) به قطعات خرد شده اضافه شد.

از سه پیپت پاستور شیشه ای با آتش با قطر مختلف (کوچک ، متوسط و بزرگ) برای جدا کردن به آرامی بافت ها با 10-12 تریتورس در هر پیپ استفاده شد ، با شروع پیپت با بزرگترین باز و با کمترین باز شدن به یکی از آنها حرکت می کندبشرهنگامی که بافت کاملاً جدا شد ، DMEM ساده به تعلیق سلول به حجم کل حدود 10 میلی لیتر اضافه شد. سپس سیستم تعلیق به مدت 5 دقیقه در 300 گرم در 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. متوسط (رویی) برداشته شد و گلوله در 1 میلی لیتر از محیط کامل عصبی تازه به حالت تعلیق در آمد.

سلولها با استفاده از هموسیتومتر شمارش شدند و در 50،000 تا 80،000 سلول در هر چاه در حجم کل 100 میکرولیتر در چاه در یک دیواره 96-سیاه استریل ، صفحه چاه پایین پاک شده با پلی D لیزین قرار گرفتند. سلول ها به مدت 1 روز در دمای 37 درجه سانتیگراد و 5 ٪ CO انکوبه شدند₂به آنها اجازه دهید تا پایبند باشند. پس از 1 روز ، 100 میکرولیتر دیگر از محیط کامل عصبی تازه به هر چاه اضافه شد. سلولها حداقل برای 10 روز اضافی انکوبه شدند و هر روز پنجم نیمی از محیط را برای محیط تازه مبادله کردند. سلولها روزانه برای تأیید تشکیل یک تک لایه سلول ، گسترش فرآیندهای عصبی و شبکه عصبی مشاهده می شدند.

اندازه گیری شار کلسیم

در 14 روز در شرایط آزمایشگاهی ، نوسانات کلسیم پایه در کشت عصبی اولیه به عنوان قله های همزمان آشکار می شود. تراکم سلولی و روزهای آزمایشگاهی عوامل اصلی تعیین کننده فرکانس و دامنه قله های کلسیم هستند. این الگوی نوسان کلسیم پایه معمولاً پس از تزریق ترکیبات یا داروهایی که در شار کلسیم درگیر هستند ، به سرعت تغییر می کند. آگونیست های کانال کلسیم یا آنتاگونیست ها. خواننده FlexStation 3 تا سه انتقال مرکب را در یک صفحه واحد خوانده شده امکان پذیر می کند و این امکان را فراهم می کند که ترکیب گسترده ای از ترکیبات یا داروها به صورت متوالی در یک آزمایش واحد آزمایش شود.

برای بارگذاری رنگ سلول ها ، 100 میکرولیتر از محیط از هر چاه برداشته شد و حجم آن 100 میکرولیتر در هر چاه باقی مانده است. محلول کار کیت قلبی اولیه Kit که حاوی رنگ حساس به کلسیم است با توجه به درج محصول تهیه شده و 100 میکرولیتر به هر چاه اضافه شده است. نورون ها حداقل به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد در تاریکی انکوبه شدند.

شار کلسیم با استفاده از یک پروتکل تجزیه و تحلیل PeakPro از کتابخانه پروتکل نرم افزار SoftMax Pro در خواننده FlexStation 3 اندازه گیری شد. صفحه با استفاده از حالت خواندن فلورسانس و نوع Flex Read خوانده شده است ، که امکان تشخیص همزمان سیگنال فلورسانس (490 نانومتر EX/525 نانومتر EM) را از پایین فراهم می کند در حالی که ترکیبات توسط سیستم انتقال مایع روی تخته به چاه ها تحویل داده می شوند. تنظیمات معمولی شامل خواندن پایه 300 ثانیه و پس از آن یک ترکیب اول در 300 ثانیه و یک ترکیب دوم در 800 یا 1100 ثانیه است. کل زمان خواندن در این روش 1900 ثانیه است. تنظیمات خاص مورد استفاده در جدول 1 نشان داده شده است. بسته به روش و داروهای مورد استفاده ، ممکن است زمان تزریق متفاوت باشد. اثری جنبشی نماینده در شکل 2 نشان داده شده است.